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1.叶绿素荧光丈量有哪些主要手艺？有没有哪种仪器可以同时实现这些丈量手艺？
答：叶绿素荧光手艺有三种主要丈量手艺蹊径：
1)PAM脉冲调制式叶绿素荧光手艺：丈量PAM荧光淬灭动力学曲线
2)直接引发式（非调制式）叶绿素荧光手艺：丈量OJIP快速荧光诱导曲线
3)双调制式叶绿素荧光手艺：时间区分率可以抵达1微秒，用于丈量QA-再氧化动力学曲线、S-state、单周转或多周转饱和光闪快速荧光动力学等
4)其它叶绿素荧光丈量手艺：如激光诱导（LIF）叶绿素荧光丈量、太阳光诱导叶绿素荧光（Solar-induced Chlorophyll Fluorescence，SIF）丈量等（拜见本条后面先容）
现在，能够同时完成上述1）至3）三种荧光动力学曲线丈量的仪器只有FL6000双调制叶绿素荧光仪、 FluorCam关闭式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统。而由于OJIP快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线敌手艺的特殊要求，对这两种曲线的成像剖析更是只有FluorCam关闭式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统能够实现。
左图： FL6000双调制叶绿素荧光仪；中图：FluorCam关闭式荧光成像系统；右图：FKM多光谱荧光动态显微成像系统
超积累植物鼠耳芥在Cd/Zn处置惩罚后的OJIP成像图与OJIP动力学曲线（Morina, 2020）
超积累植物鼠耳芥在Cd/Zn处置惩罚后的PAM荧光淬灭显微成像图与QA-再氧化动力学剖析（Morina, 2020）
Z6尊龙凯时生态手艺公司提供叶绿素荧光手艺周全解决计划，除古板的PAM手艺、OJIP丈量手艺、双调制手艺外，还提供叶绿素荧光高光谱成像和激光诱导（LIF）叶绿素荧光高光谱成像手艺计划，不但可以剖析植物叶绿素荧光二维异质性漫衍，还进一步从高光谱纬度剖析叶绿素荧光光谱特征，并成像剖析Fr（叶绿素荧光红色峰值）、Ffr（叶绿素荧光远红峰值）、Fr/Ffr、F735/F700（与叶绿素浓度呈直线相关）及基于叶绿素荧光差别峰值（红色峰值Fr和远红峰值Ffr等）的叶绿素荧光参数。LIF叶绿素荧光高光谱成像手艺可实现大田叶绿素荧光近地遥感丈量。
左图：叶绿素荧光参数Fr/Ffr成像；右图：叶绿素荧光光谱（Z6尊龙凯时光谱成像与无人机遥感研究中心提供）
2.丈量叶绿素荧光的光源为什么最好具备两种以上颜色？什么颜色的光源最好？
答：在FluorCam叶绿素荧光成像系统中一样平常推荐的光源组成是这样的：
5)丈量光：红光
6)光化光：红光+白光或红光+蓝光
7)饱和脉冲光：白光或蓝光
在脉冲调制手艺中，丈量光最主要的作用是丈量最小荧光F0。而在引发F0时，要求光反应中心不爆发电荷疏散和热耗散。在引发叶绿素荧光的可见光波段中，红光波长最长，能级最低，能够确保叶绿素分子被引发到较低的引发态。而蓝光等波长较短的光在引发叶绿素荧光时则可能造成热耗散。因此红光最佳的荧光丈量光源。
左：荧光淬灭丈量历程中qN与qP的转变；右：红光和蓝光引发叶绿素荧光的差别
在光化光和饱和光的选择上，则主要思量荧光引发效率问题，这与植物/藻类样品中光合色素的吸收光谱是亲近相关的。如下图可见，红光和蓝光对应叶绿素吸收峰，引发叶绿素荧光效率最高，也可用于研究植物/藻类对差别光质的响应。白光是一连光谱，可模拟自然光，同时兼顾种种光合色素。红光能级较低，一样平常不推荐作为饱和脉冲光源。FluorCam也可定制其他波段光源针对特定样品，尤其是藻类样品，好比590 nm琥珀光、530nm青光、505nm绿光等。
两种或两种以上光化学光的另一个优势是，可举行差别光质光和效率研究及光生物学研究，如下图所示（引自Sander W. Hogewoning等，Blue light dose-responses of leaf photosynthesis, morphology, and chemical composition of Cucumis sativus grown under different conbinations of red and blute light. Journal of Experimental Botany, 2010）
3.FluorCam有哪些PAM脉冲调制丈量功效与参数？
答：FluorCam主要的PAM脉冲调制丈量功效和获得的参数如下：
?Fv/Fm：丈量参数包括F0，Fm，Fv，Fv/ Fm等
?Kautsky诱导效应：F0，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等荧光参数
?荧光淬灭剖析：F0，Fm，Fp，Fs，Fv，Fv/ Fm，QY，F0’，Fm’，Fv’/ Fm’，NPQ，qP，Rfd，qN，qL等
?光响应曲线：F0，Fm，Fv/ Fm，差别光强下QY，Fv’/ Fm’，NPQ，qP，ETR等
详细参数可参阅下表：
参数符号看法形貌
参数符号 |
看法形貌 |
Fo |
暗顺应后的最小荧光 |
Fo_Dn |
暗弛豫历程中的最小荧光，D代表暗弛豫历程，n代表丈量历程中第n次饱和脉冲获得的数据，下同 |
Fo_Ln |
光顺应历程中的最小荧光，L代表光顺应历程，下同 |
Fo_Lss |
光稳态最小荧光，ss为steady-state缩写，代表稳态，下同 |
Fm |
暗顺应后的最大荧光 |
Fm_Dn |
暗弛豫历程中的最大荧光 |
Fm_Ln |
光顺应历程中的最大荧光 |
Fm_Lss |
光稳态最大荧光 |
Fp |
光顺应历程初始阶段的峰值荧光 |
Ft_Dn |
暗弛豫即时荧光 |
Ft_Ln |
光顺应即时荧光 |
Ft_Lss |
光顺应稳态荧光 |
Fv |
暗顺应后的可变荧光，=Fm-Fo |
NPQ_Dn |
暗弛豫历程中的非光化荧光淬灭，＝(Fm-Fm_Dn)/Fm_Dn |
NPQ_Ln |
光顺应历程中的非光化荧光淬灭，＝(Fm-Fm_Ln)/Fm_Ln |
NPQ_Lss |
光稳态非光化荧光淬灭，＝(Fm-Fm_Lss)/Fm_Lss |
qP_Dn |
暗弛豫历程中的光化学荧光淬灭，＝(Fm_Dn?Ft_Dn)/Fm_Dn?Fo_Dn |
qP_Ln |
基于“Puddle”模子的光顺应历程中的光化学淬灭，＝(Fm_Ln?Ft_Ln)/(Fm_Ln?Fo_Ln) |
qP_Lss |
基于“Puddle”模子的光稳态光顺应光化学淬灭，＝(Fm_Lss?Ft_Lss)/(Fm_Lss?Fo_Lss) |
qL_Ln |
基于“Lake”模子的光顺应历程中的光化学淬灭，＝qP_ Ln×(Fo_ Ln /Ft_ Ln) |
qL_Lss |
基于“Lake”模子的光稳态光顺应光化学淬灭，＝qP_Lss×(Fo_Lss /Ft_Lss) |
QY_Dn |
暗弛豫历程中的现实光量子效率，＝(Fm_Dn?Ft_Dn)/Fm_Dn |
QY_Ln |
光顺应历程中的现实光量子效率，＝(Fm_Ln?Ft_Ln)/Fm_Ln |
QY_Lss |
光稳态现实光量子效率，＝(Fm_Lss?Ft_Lss)/Fm_Lss |
QY_max（Fv/Fm） |
暗顺应后的最大光量子效率，=Fv/Fm |
Fv/Fm_Ln |
光顺应历程中的最大光量子效率，＝(Fm_Ln?Fo_Ln)/Fm_Ln |
Fv/Fm_Lss |
光稳态最大光量子效率，＝(Fm_Lss?Fo_Lss)/Fm_Lss |
Rfd_Ln |
光顺应历程中的荧光衰减率，用于评估植物活力，＝(Fp?Ft_Ln)/Ft_Ln |
Rfd_Lss |
稳态荧光衰减率，用于评估植物活力，＝(Fp?Ft_Lss)/Ft_Lss |
ETR |
电子转达速率，ETR=QY_Lss×PAR×0.5×0.84(PAR吸收率)，PAR吸收率可通过PAR吸收丈量�？榫傩行拚� |
4.主要叶绿素荧光参数的值域规模是几多？相互关系是怎么样的？
答：一样平常来说，Fm ≥ Fp ≥ Ft ≥ Fs ≥ Fo，Fo’ ≥ Fo，Fm’ ≤ Fm，暗弛豫（actinic light关闭后）的Fm ≤ 暗顺应的Fm，Fp和Fm’没有严酷崎岖关系。
最大光化学效率Fv/Fm或QYmax值域0 – 1。但现实上，在理想状态下保存上限。：
?C3植物：0.83 - 0.84 (Bjorkman and Demmig 1987)
?C4植物：0.78 (Pfundel 1998)
?藻类：常低于0.7 (Trissl and Wilhelm 1993)
这一上限在差别文献中保存差别，但一样平常来说，C3植物在实验中比照组数据要争取大于0.8，最高不可高于0.86。
现实光化学量子效率或量子产额QY或ΦPSII值域0 ? 1，≤ Fv/Fm，一样平常随Actinic light升高而降低。
Rfd值域为0 ? ∞ ，一样平常在0 – 6。
qN、 qP、 qL值域为0 – 1。
NPQ值域为0 ? ∞，一样平常在0 – 4。因此，有的文献中会使用NPQ/4这一参数来对其归一化。
5.FluorCam软件中的荧光参数似乎与文献中的有些差别，一样平常文献中使用的参数对应FluorCam软件中的哪个参数？
答：软件中为了便于识别与区分，与文献中的一样平常形貌有所差别。一样平常文献中提到的参数在FluorCam软件中的显示如下：
文献中的参数FluorCam软件中的参数
软件参数后缀L代表光顺应历程，D代表暗弛豫历程， ss为steady-state缩写，代表稳态。Lss即为光稳态。
关于光顺应条件下的荧光参数，文献中都默认使用的是光稳态时的对应参数。FluorCam软件中特殊以Lss后缀加以区分。而其他的L1、L2、D1、D2等对应的参数则可以表征体现光顺应或暗弛豫从起始到稳态的转变历程。
在光响应曲线Light Curve丈量中，由于每一个光强梯度均抵达光稳态，因此参数后缀均为Lss，差别数字体现差别的光强梯度。
QY在中英文文献中可能会有多种差别的表述要领，但现实上其代表的意义是相同的，即光顺应下的真实光能转化效率，盘算公式也是相同的。
6.光顺应下的最小荧光F0’是怎样丈量的？
答：最小荧光 F0是在暗顺应条件下丈量获得的，这时PSII光反应中心处于完全开放状态（qP=1）。而在光顺应下PSII光反应中心处于部分关闭的状态（0＜qP＜1），这时间怎么可能丈量最小荧光呢？
以前，由于手艺限制，所有叶绿素荧光仪器都不可直接丈量F0’。1997年，Oxborough和Baker提出了一个F0’的估算公式：
之后的一系列研究证实，这个公式估算获得的数据是可信的。纵然是现在，大部分没有明确说明的叶绿素荧光仪器依然是使用这个公式举行估算。
但这个数据终究不是直接丈量获得的，在许多光合研究中是无法代表。随着LED手艺的前进，FluorCam则通过配备专用的远红光源板来对F0’举行实测。这是使用了远红光只会引发PSI而不引发PSII的特征。在光顺应刚刚竣事，光化光关闭时，连忙照射远红光，使PQ库氧化，强制PSII抵达完全开放的状态，从而对F0’举行实测。
从另外一个方面说，没有配备远红光源的叶绿素荧光仪或者荧光成像仪都是不可现实丈量F0’的。同时，有些荧光成像仪纵然配备了远红光源，但由于其远红光源没有与PAM脉冲调制丈量程序联动，也不可现实丈量F0’。
7.叶绿素荧光丈量前为何要举行暗顺应？必需要举行暗顺应吗？
答：暗顺应是为了测最大荧光Fm和最小荧光Fo。
植物/藻类在经由一定的暗顺应后，QA最洪流平被氧化，光反应中心完全“开放”，此时仪器运行程序则自动发出丈量光，才以测得最小荧光F0。此丈量光极小，不可引起光化学反应。也可不举行暗顺应直接丈量，运行Fv/Fm程序，丈量获得的QYmax=QY（现实光量子效率）。
8.已经有叶绿素荧光仪了，是否尚有须要买叶绿素荧光成像仪？
答：有须要。叶绿素荧光仪为点丈量，获得众多荧光参数值，单次丈量难以反应样品的整体特征，可多次丈量取平均值等。比起荧光仪，叶绿素荧光成像仪有以下不可替换的优点：
?数据效果可以是整个样品的平均值，可反应样品的整体特征，阻止样品差别造成的误差；也可以通过ROI选区工具自动或手动选择差别区域举行剖析
?成像图能够周全反应整株植物、叶片、藻类群体等的差别位置荧光强度转变与漫衍，即光相助专心理生态及胁迫的异质性漫衍状态。
?可丈量叶片、果实、麦穗、大型藻/微藻、整株植物以致植物冠层等种种样品。
?可同时测定几十、甚至上百株个样品。
?能够在显微水平研究叶绿体或藻类细胞。
?尤其适用于情形胁迫早期植物差别部位光合活性的转变纪律、突变体差别部位的光合功效差别等研究。 
9.叶绿素荧光丈量时怎样选择光质？
答：叶绿素荧光丈量主要针对叶绿素a，叶绿素a的两个光谱吸收波峰在蓝紫光波段和红光波段，因此选择蓝光、红光或者白光（复合光）一样平常均可。其中注重，蓝藻丈量时只管选择红光。
10.叶绿素荧光丈量必需在植物活体上丈量吗？
答：原则上，叶绿素荧光丈量因只管对样品活体原位检测。条件不允许时可以丈量离体叶片，但只管在活体状态下举行暗顺应处置惩罚，测试时离体时间不凌驾15-20分钟。但详细情形也要看样品在离体后失水影响的详细情形，有些样品则在短时离体后就会萎蔫卷曲，如水稻，而有些样品可耐受长时间离体，如一些革质叶片。离体检测只管使用湿纱布等包裹叶梗，如需光下转运可使用两片湿滤纸夹住叶片，阻止叶片失水，影响丈量效果。
11.NPQ为负值应当怎样解决？
答：一样平常是丈量参数设置不当造成的，可实验将饱和脉冲光适当调大或光化光适当调小。有些是样品特征造成的，这种情形可实验替换光质。
12.是否能获得ETR？怎样获得ETRmax？
答：叶绿素荧光丈量仪运行LC1~3程序，叶绿素荧光成像运行LightCurve程序，均可获得ETR。ETRmax则需使用sigma plot等工具软件，拟合光响应曲线RLC来获得。（参考文献：Ralph P J, Gademann R. Rapid light curves: A powerful tool to assess photosynthetic activity[J]. Aquatic Botany, 2005,82(3):222-237. 更多参考文献可联系Z6尊龙凯时获�。�
13.叶绿素荧光成像时对样品有何要求？
答：要求样品无任何遮挡，只管平铺，整株植物成像则最好对统一水平高度的部分举行检测。大型藻可有水湿润但水不要没过样品。配景只管纯粹并且为玄色或者非反光材质。阻止使用锡纸、塑料板等反光物品。丈量时一样平常选用叶片正面，而当叶片背面首先遭受病虫害时，则也可对背面举行检测。
14.我的差别处置惩罚组样品是脱离成像的，那在写论文时怎样将图片放在一起比照？
答：属于统一实验且需要生涯的成像图，必需将其彩色标尺调解为相同的区间。详细办法如下：
1）点选软件result界面右下方Group color前√ ，统一类参数将使用统一彩色标尺。
2）点选右下方Manual color前√ ，手动设定标尺规模，右键生涯成像图。
3）差别处置惩罚样品重复以上办法，所有样品统一参数的成图像标尺规模必需设定一致。
4）设定标尺规模的标准：切合对应参数的理论规模，好比Fv/Fm、QY不凌驾0-1，NPQ一样平常不凌驾0-4等；为了突出成像效果，可缩小标尺规模，但要确保成像图上主要的像素点在这一规模内
15.可以通过FluorCam评估叶绿素浓度吗？
答：有三种要领可以评估叶绿素浓度：
1）最小荧光F0、最大荧光Fm和OJIP快速荧光参数Area都与叶绿素浓度有正相关性，有许多相关的文献举行过探讨（Chen，2021，2017）。但由于叶绿素荧光参数同时与光合状态有关，因此在使用上应小心。
2）通过PAR吸收�？槭迪�。通过这个�？檎闪颗趟愕腘DVI植被归一化指数，与叶绿素浓度成正相关，这一参数自己就普遍用于大田遥感普查、森林生态监测等。同时成像图能够反应叶绿素浓度异质性。
3）通过紫外引发多光谱荧光成像实现。丈量的F690/F740与叶绿素浓度为负相关。现在已有研究其用于作物氮素营养状态评估。
浙江大学应用FluorCam多光谱荧光成像手艺举行油菜氮素营养快速评估（Sun，2020）
16.在使用FluorCam软件导出数据时，使用Frame numeric照旧 numeric average更好？
答：通常，我们建议使用numeric average。以盘算Fv/Fm为例，Frame numeric是指先盘算每个像素的Fv/Fm，然后再除以像素数求得区域平均Fv/Fm。而numeric average，则是先获得整个区域的平均F0、平均Fm，再以此盘算Fv/Fm。若是剖析历程中，样本信号强，噪点很少，两种方法的差别不显着。若是样本荧光信号弱，并且保存噪点，则选择numeric average更好。
17.FluorCam显示pixels overflow是什么意思？对数据有何影响？怎么修正？
答：高迅速度CCD相机检测荧光的规模为0-4096个单位，高区分率CCD相机则在0-65536。凌驾该信号就会警示pixels overflow即信号溢出。在最先实验丈量前，您需要在live窗口调解shutter和sensitivity，以及设置适合的光强。在翻开flash情形下调解shutter和sensitivity使暗顺应后的样品荧光值处于较低数值（此时显示的荧光值着实F0）。我们通常建议高迅速度CCD相机设置到500-1000，高区分率CCD相机设置到5000-10000。差别的植物需要差别的设置，建议预实验探索。
18.Shutter和sensitivity怎样影响成像质量？为了获得最佳效果，建议哪些组合设置？
答：详细的设置要领参考说明书。简短来说，shutter即快门时间，同时还控制丈量光的一连时间，一样平常不凌驾20或30ms ，sensitivity即迅速度。两者越高，荧光信号值越高，太高则凌驾正常F0的规模。Shutter一样平常建议设置10-20us，最大不凌驾33us。Sensitivity越高信噪比越低，建议一样平常不凌驾50％。
19.盐胁迫水稻幼苗非光化学荧光淬灭成像：视频中动力学曲线随着胁迫加重而上升说明晰什么，尚有怎么去剖析此类型的动力学曲线？
答：动力学曲线随胁迫加重上升一样平常是由于胁迫导致PSII光化学反应活性降低，光能转化效率低，更多的光能以荧光的形式散失，以是导致荧光信号增强。
荧光动力学曲线的剖析通常有两种方法：一是较量差别样品在暗顺应-光顺应-暗弛豫3个阶段的荧光强度转变的差别，考察PSII对光强转变的顺应性和可塑性以及每个阶段的PSII的活性及电子转达状态。剖析效果都是定性形貌，定量剖析仍需借助盘算值；另外一种剖析方法是将动力学曲线上的特征性荧光强度（如Fm_Ln，n代表第一再脉冲）作为变量，和盘算值（如Fv/Fm）一起输入到数学模子中，从而筛选出能够反应胁迫水平的特征参数。后者可参考以下论文：
龙燕, 马敏娟, 王英允,等. 使用叶绿素荧光动力学参数识别苗期番茄干旱胁迫状态[J]. 农业工程学报, 2021, 37(11):8.
20.叶绿素荧光丈量手艺与光合仪的区别？
答：两者都是研究植物和藻类光相助用的有用工具，可是着重差别。
光合仪主要丈量植物的宏观参数，如光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度等，以评估权衡植物光相助用的强度和能力，并标配或可选配微天气控制如光、温、湿、CO2�？�。
叶绿素荧光不但能反应光能吸收、引发能转达和光化学反应等光相助用的原初反应历程，并且与电子转达、质子梯度的建设及ATP合成和CO2牢靠等历程有关，是研究植物光相助用的“探针”。
两者团结丈量在植物光合心理研究中可以有用互补，可普遍应用于权衡植物生长状态，差别胁迫处置惩罚对植物光系统的影响，评价生态系统碳收支与全球天气转变的相互关系，植物光系统对全球转变响应等方面。
21.蓝藻光合参数的测定
答：由于蓝光无法引发蓝藻PSII主要的天线色素藻胆素，只能引发叶绿素，而蓝藻中PSI中的叶绿素要多于PSII，这会使PQ库部分氧化，以是需要选择蓝光以外的引发光源，如UV365nm、cyan470nm、green530nm、orange625nn。
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